关键词：静态流动模式、BSA蛋白、分子量分布

BeNano静态流动模式适用于与凝胶渗透色谱GPC/SEC连接使用，其中GPC设备可以配置一个示差折光检测器或者一个紫外检测器，可以依赖于样品组分的大小将每个组分分离，并依次流出。

BeNano静态流动模式在90°使用PD检测器收集样品散射光强度信号，并同时收集示差折光检测器或者紫外检测器信号，结合这两个信号计算得到每个流出组分的绝对分子量和分子量分布信息。由于BeNaon采用的是单角度静态光散射，根据瑞利散射理论，只要分子大小不超过波长1/40，结果的准确性都能够得到保证，这尤其适合蛋白质类样品的检测。BeNano对于不同种类样品的准确检测上限如下表：

在这个应用中，我们将BeNano主机与SEC前端相连接，检测了BSA牛血清蛋白样品的分子量和分子量分布信息。

原理和设备

前端凝胶色谱中使用了市场中某主流品牌SEC，具有RI检测器，使用TSK氧化硅柱进行分离。

测试采用丹东百特BeNano 180 Zeta Max纳米粒度及Zeta电位分析仪，仪器使用波长671 nm、功率50 mW激光器作为光源，在90°进行光散射信号收集。测试使用了27μL 低容量流通池作为检测池。利用BFC-1信号采集器收集前端SEC设备的示差折光检测器输出的模拟信号。

样品制备和测试条件

将BSA分散在pH=7的PBS缓冲液中，配置浓度为5mg/mL。进样量100 μL，流速为0.7mL/min。

通过前端SEC进行进样，分离。分离后的样品组分逐一进入RI检测器和BeNano进行信号收集。BeNano温度控制在25℃，基本与室温一致。

测试结果和讨论

图1. BSA牛血清蛋白色谱流出曲线（上图）和分子量流出曲线（下图）

图1可以看出，BSA样品经过色谱柱分离得到若干个流出峰，说明BSA在PBS中形成一系列团聚状态。对于RI和光散射信号进行基线设定和积分线设定，得到每一个峰对应的分子量，得到的分子量列于表1中。

图2为对于整体信号积分得到的整体分子量流出曲线。通过分子量随流出体积曲线可以看出，分子量随着流出体积逐渐降低，这符合凝胶色谱的分离原理。在每一个峰内，分子量均形成平台，这符合蛋白质每个峰内某种寡聚状态的分子量都分布极窄的特征。

表1. BSA峰内分子量Mw结果

通过表1每个峰的分子量可以看出，峰1（最后的流出峰）的分子量为66K，这与BSA的理论分子量一致，峰2-4的分子量均为峰1的倍数，说明峰2-4分别为二聚体、三聚体和四聚体。

结论

在该应用报告中，利用BeNano静态流动模式检测了BSA样品的分子量信息。通过结果可以看出，BeNano静态流动模式可以分别准确地得到一系列BSA样品流出峰的分子量，通过分子量值可以准确判断出各个流出峰对应的团聚状态。